Методы выявления нервной ткани. Тема лекции: гистология нервной ткани

Окрашивание нервной ткани

При морфологических исследованиях нервной ткани на светооптическом уровне применяют большое количество методов окрашивания, многие из которых модифицированы. Чаще всего это избирательные (элективные) методы, используемые для выявления одного или двух элементов. С определенной целью применяют комбинированные методы.

ФИКСАЦИЯ

При изучении нервной ткани из простых фиксаторов наиболее часто используют 10 - 20 % раствор формальдегида и 96 % и 100 % спирт, из фиксирующих смесей - сулему и пиридин. Существуют также специфические фиксаторы, применяющиеся только при исследовании элементов нервной ткани.

Фиксирующая смесь Рамон-и-Кахаля (для выявления глии):

нейтральный формалин 15 мл

бромид аммония 20 г

дистиллированная вода 85 мл

Смесь применяют для серебрения глии по Рамон-и-Кахалю -Хортеге.

Продолжительность фиксации тонких (до 1,5 см) кусочков материала 2 - 15 дней.

Промывание в проточной воде.

Фиксирующая смесь Рамон-и-Кахаля (для выявления нейро-фибрилл):

пиридин 40 мл

96 % спирт 30 мл

Продолжительность фиксации 2 ч.

Промывание в проточной воде в течение 1 ч.

ОБЕЗВОЖИВАНИЕ

Особенностью обработки нервной ткани является ее тщательное обезвоживание. Для обезвоживания кусочков толщиной 5 -б мм используют следующую схему:

50 % спирт 2 ч

70 % спирт 6 ч

80 % спирт 6 ч

96 % спирт 6 ч

100 % спирт I 6 ч

100% спирт II 6 ч

Продолжительность обезвоживания 32 ч

НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЗАЛИВКИ НЕРВНОЙ ТКАНИ

Нервную ткань для гистологического исследования заливают в парафин, целлоидин и желатин. Методика заливки в парафин и целлоидин никаких особенностей обработки нервной ткани на этой стадии нет.

Заливка в желатин по Снесареву

Метод пригоден для эмбриологических исследований. Преимущество его заключается в том, что он не вызывает сморщивания материала. Рекомендуется для выявления тонкой межклеточной структуры соединительной ткани, а также для некоторых цитологических исследований.

Для заливки берут бесцветный прозрачный пищевой желатин и вначале из него готовят 25 % раствор. Для этого мелко нарезают нужное количество желатина, насыпают в широкогорлую банку и ставят в термостат при 37 °С до растворения. После этого часть приготовленного желатина разводят пополам теплым 1 % раствором фенола (карболовой кислоты) и таким образом получают 12,5 % раствор. Растворы желатина лучше готовить в небольших количествах по мере надобности.

После фиксации тщательно промытый материал переносят в 12,5 % раствор желатина, где держат в зависимости от величины кусочков от 1 - 2 ч до 1 - 2 сут, затем на такое же время переносят в 25 % раствор желатина при 37 °С. После заливки следуют быстрое охлаждение в холодильнике и уплотнение в 5- 10 % формалине. Блоки режут только на замораживающем микротоме.

ОКРАШИВАНИЕ НЕЙРОНОВ

Окрашивание метиленовым синим, которое Ниссль положил в основу изучения эквивалентной картины нервных клеток, основано на перекрашивании фиксированных в спирте срезов основным анилиновым красителем с последующим отмыванием его избытка спиртом. При этом составные части клеток сильнее удерживают краситель, чем масса волокон, которая дифференцируется быстрее. В результате интенсивно окрашенный клеточный материал резко выделяется на бесцветном фоне. В окрашивании клеток участвуют как ядерные структуры, так и вещества, находящиеся в цитоплазме нервных клеток,- тигроидные глыбки; глыбки, или вещество Ниссля.

Под эквивалентной картиной клетки F. Nissl понимал «картину микроскопической структуры имеющихся в ткани нервных клеток животного, убитого определенным образом, которая может быть закономерно воспроизведена при определенной микротехнике обработки нервной ткани, находящейся в определенных экспериментальных условиях».

Со временем метод Ниссля был упрощен. Даже основное требование F. Nissl - фиксация препаратов этиловым спиртом - выполняют частично, поскольку метод часто применяют для обработки материала, фиксированного в формалине. Однако в ответственных случаях следует рекомендовать по возможности проводить окрашивание материала, который был фиксирован по прописи в спирте. Что же касается указаний F. Nissl о резании и окрашивании, то их вполне можно заменить без ущерба для результата обычным спирт-целлоидиновым методом и более контрастным окрашиванием толуидиновым синим или тионином.

Метод Ниссля

Фиксация.

Острыми ножницами вырезают кусочки ткани мозга в форме кубиков и сразу, без соприкосновения с водой, помещают в большое количество 96 % спирта. Кусочки не должны быть ни слишком большими, ни слишком маленькими (длина сторон не менее 1 см). Важно, чтобы кусочек ткани со всех сторон омывался спиртом (положить на вату), который в 1-й день нужно сменить, по крайней мере, 1 раз, в дальнейшем обновлять каждые 2 дня.

Получение срезов.

Через 5 дней блок обычно достигает необходимой консистенции. Его сторону, предназначенную для наклейки, ровно срезают острой бритвой так, чтобы толщина блока не была более 6 - 8 мм, размер плоскости среза может быть любым. На ровную поверхность деревянной колодки, служащую для наклейки, наносят раствор гуммиарабика консистенции меда. Поверхность кусочка мозга промокают фильтровальной бумагой и легким нажимом вдавливают в раствор гуммиарабика так, чтобы он всюду хорошо прилегал к деревянной колодке. Затем блок переносят обратно в 96 % спирт, где гуммиарабик белеет и быстро уплотняется. Через несколько минут блок можно резать.

Блок режут косо поставленным ножом, смоченным спиртом, причем стараются срезы толщиной 10-15 мкм по возможности полностью расправить с помощью смоченной спиртом кисточки. Срезы собирают в чашку с 96 % спиртом. Долго хранить их в спирте нельзя, следует сразу же подготовить к окрашиванию. Блок, наоборот, можно хранить в спирте довольно долго: для этого его нужно снять с деревянной колодки.

Окрашивание срезов.

Срезы окрашивают в часовом стекле с красящим раствором, в состав которого входят 3,75 г метиленового синего В, 1,75 г наскобленного венецианского мыла, 1 л дистиллированной воды. Красящий раствор осторожно подогревают до появления паров. Затем расправленные срезы переносят для дифференцировки в свежеприготовленную смесь из 10 мл совершенно прозрачного анилинового масла и 90 мл 96 % спирта. Дифференцируют до прекращения отхождения крупных облачков краски. Затем срез помещают на предметное стекло, просушивают гладкой фильтровальной бумагой, быстро покрывают кайепутовым маслом, снова просушивают, поливают бензином (не давать подсохнуть!) и покрывают канифолью с ксилолом (насыщенный раствор канифоли в ксилоле). Предметное стекло осторожно подогревают до испарения ксилола, после чего на еще горячий слой канифоли накладывают подогретое покровное стекло. Красящий раствор перед использованием взбалтывают и фильтруют.

Свежеприготовленный красящий раствор должен созревать не менее 3 мес. Этот метод является основной высоко специфической методикой окрашивания нервных клеток для изучения в них выраженных патологических и структурно-функциональных изменений в световом микроскопе. Основу его составляет способность выявлять с помощью основных красителей специфичный для нейронов нуклеопротеидный комплекс (тигроид), содержащийся в цитоплазме и дендритах, а также другие комплексы РНК и основных белков (ядрышко, хроматин ядра).

==========================================================

Окраска по Нисслю

==========================================================

Упрощенный метод Ниссля

Фиксированный в спирте материал заливают в спирт-целлоидин.

Срезы собирают в 70 % спирт, где их можно хранить долгое время.

Методика окраски

1. Расправленные срезы помещают в 0,1 % раствор толуидинового синего или тионина, который после этого дважды нагревают до появления паров.

2. После охлаждения ополаскивают в воде и 70 % спирте.

3. Дифференцируют в 96 % спирте.

4. Проводят через 100 % спирт, ксилол, бальзам или окрашивают, как указано выше; дифференцируют в анилиновом масле со спиртом.

5. Извлекают срезы на предметное стекло, просушивают фильтровальной бумагой.

6. Просветляют кайепутовым маслом, затем масло сливают.

7. Просушивают, проводят через ксилол и заключают в бальзам.

Результат: глыбки тигроида, ядерная оболочка и ядрышки интенсивно синие или фиолетовые, цитоплазма ганглиозных и глиальных клеток бледно-синяя, волокнистое нервное вещество не окрашено.

==========================================================

ОКРАШИВАНИЕ НЕРВНЫХ ВОЛОКОН

Ускоренный метод Гольджи

1. Кусочки ткани, по возможности свежей, помещают в смесь из 40 мл 2,5 % (до 3,5 % по Кахалю) бихромата калия и 10 мл 4 % тетраоксида осмия при 20 - 25 °С в коричневую склянку на стек­лянную вату так, чтобы жидкость проникала со всех сторон. Указанного количества, жидкости достаточно для 5 - 6 кусочков. Ку­сочки не должны быть слишком большими или слишком малень­кими (толщина 2 - 3 мм, площадь поверхности 5 - 10 мм2).

Продолжительность воздействия заранее нельзя указать, так как для каждого объекта она различна, поэтому всегда кладут в смесь большое количество кусочков и вынимают их из раствора в течение 2 - 7 дней с промежутками около 12 ч.

2. Кусочки обсушивают фильтровальной бумагой и погружают в небольшое количество 0,75 % раствора нитрата серебра, который в случае необходимости несколько раз меняют до пре­кращения образования осадка, затем помещают на 1 - 2 дня (на 1-6 дней по Рамон-и-Кахалю) в 100 мл 0,75 % раствора нитра­та серебра при комнатной температуре или 35 °С (не выше), лучше в темноте.

3. Промывают в 40 % спирте (1 -2 ч), сменяя его несколько раз. Переносят в 80 % и 96 % спирты. Затем кусочки зажимают в уплотненную печень или проклеивают гуммиарабиком и режут бритвой или на микротоме, смачивая спиртом (толщина срезов 20-100 мкм). Если кусочки после уплотнения в спирте перенести обратно в воду, то их можно резать и на замораживающем микротоме. Кусочки можно также быстро залить в целлоидин, для чего их обезвоживают в 100 % спирте 12 ч, спирт-эфире 2 -4 ч, 4 % целлоидине 1 - 2 дня, накладывают на деревянный или лучше стабилитовый блок, обливают густым раствором целлоидина и уплотняют на воздухе или в 80 % спирте. Если ткань при резке сильно крошится, то блок после каждого среза смазывают жидким раствором целлоидина.

Кусочки также можно поместить на 1-4ч в 100% спирт, на 1 ч в смесь 100 % спирта и эфира (1:1), а затем на несколько часов в жидкий целлоидин (в сосуд со свободно сидящей пробкой). После этого объект уплотняют в парах хлороформа и режут в 96 % спирте.

Срезы тщательно промывают в 80 % спирте для удаления избытка серебра, обезвоживают в абсолютном спирте, просветляют в креозоте, а затем в скипидаре.

После этого срезы переносят на покровное стекло, осторожно отсасывают масло и наносят каплю густого бальзама, которую распространяют по всему препарату. В таком виде препарат оставляют на несколько дней сохнуть в месте, защищенном от пыли, и, наконец, укрепляют покровное стекло срезом вниз на продырявленном предметном стекле или деревянной дощечке. Таким образом, препарат не следует заключать между предметным и покровным стеклами, так как в этом случае импрегнация разрушается в короткий срок.

Результат: при удавшейся импрегнации на светлом фоне выделяются отдельные темно-черные ганглиозные клетки вместе с отростками.

Наиболее легко удается импрегнация ганглиозных клеток на материале, взятом от молодых животных (поздние эмбрионы, 1 -10-дневные животные). Особенно благоприятными объекта­ми являются головной и спинной мозг птенцов голубя.

Выраженное влияние на результаты оказывает продолжительность хромирования. Точные рекомендации, к сожалению, дать невозможно, так как для каждого объекта она различна и зависит от состояния препарата, температуры, концентрации, количества жидкости и др. Сроки устанавливают чисто эмпирически: для ганглиозных клеток ЦНС обычно 3 - 5 дней, для глии 2 - 3 дня, для нервных волокон 5-7 дней. При слишком кратковременном хромировании появляется лишь диффузный осадок хромата серебра, при слишком длительном находят только резко отграниченные кристаллы, импрегнация же отсутствует.

Кусочки ткани обычно окружены толстым слоем осадка серебра, который может затруднять наблюдение, особенно в случае тонких препаратов мембран, так как покрывает большую часть препарата. В связи с этим перед помещением кусочков в раствор нитрата серебра целесообразно несколько раз быстро погрузить их в 10 % раствор желатина, т.е. окружить желатиновой оболочкой. После серебрения от желатина освобождаются путем быстрого погружения кусочков в теплую воду, насыщенную хроматом серебра.

Объекты, находившиеся слишком долго в растворах, содержащих хром, еще могут быть пригодны для импрегнации по Гольджи, если их обрабатывать в течение 1 - 14 дней в часто сменяемой смеси равных частей 2 - 3 % раствора бихромата калия и 4 -5 % раствора сульфата меди; из этой смеси объект переносят в ванну с нитратом серебра.

Надежность метода Гольджи повышается при 2- или 3-кратном импрегнировании по Кахалю. Благодаря этому часто можно «спасти» импрегнацию, оказавшуюся в первый раз неудачной.

При повторном импрегнировании поступают так, как при использовании метода Гольджи (быстрого). Обсушивают кусочек на фильтровальной бумаге и помещают в ранее использовавшуюся смесь бихромата калия и тетраоксида осмия, а затем на 1 сут в раствор нитрата серебра, применявшийся ранее. Ополаскивают дистиллированной водой, обсушивают фильтровальной бумагой. Погружают на 1 - 2 мин в 96 % спирт, обсушивают фильтровальной бумагой. Делают блок с помощью гуммиарабика или парафина и режут, смачивая 96 % спиртом. Толщина срезов 80-100 мкм; срезы промывают в 96 % спирте, сменяемом 5 - 6 раз, в общей сложности не дольше 30 мин. Переносят на предметное стекло, прижимают фильтровальной бумагой и заключают (по методу Гольджи). Приведенные выше процедуры можно повторить и в 3-й раз.

==========================================================

Медленный метод Гольджи

Маленькие кусочки органов помещают в жидкость Мюллера или 3 % раствор бихромата калия, концентрацию которого постепенно повышают до 5 % (в сосуде из коричневого стекла). Через 4 - 6 недель проводят первую пробу; для этого один кусочек обсушивают фильтровальной бумагой, ополаскивают в 0,75 % растворе нитрата серебра, а затем кладут в такой же раствор на 24 ч. Если на сделанных бритвой срезах с материала не обнаруживают никакой импрегнации, то пробу повторяют через 8 дней. После того как наступит импрегнация, материал обрабатывают по методу Гольджи, начиная с пункта 3.

Специальные методики импрегнации нервных клеток с отростками и контактным аппаратом

Метод Гольджи-Дейнеки

(для выявления синапсов)

1. Материал фиксируют в свежем растворе АФА (состоит из равных частей 96 % спирта, 20 % нейтрального формалина и насыщенного раствора мышьяковистой кислоты) до 3 ч.

2. Промывают в 1 % растворе нитрата серебра и оставляют в этом растворе на срок от 18 дней до 2,5 мес.

3. Промывают в дистиллированной воде 3 - 4 мин.

4. Переносят в восстановительную смесь, в состав которой входят 2 г гидрохинона, 0,5 г сульфита натрия, 5 мл 40 % нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды, на 1 сут.

5. Промывают в дистиллированной воде.

6. Проводят через 70 %, 80 %, 96 % спирты по 3 ч в каждом и оставляют в 100 % спирте на ночь.

7. Переносят в 6 % целлоидин на 2 - 3 сут, затем в 8 % целлоидин на 2 сут (лучше только в 6 % целлоидин на 2 - 3 сут).

8. После заливки на блоках готовят срезы толщиной от 15 до 30 мкм и переносят их в 70 % спирт.

9. Промывают срезы в дистиллированной воде и погружают до почернения в вираж (1,5 г тиосульфата натрия, 1,5 г тиоцианата аммония, 50 мл дистиллированной воды, на каждые 10 мл виража 1 мл 1 % трихлорида золота).

10. Промывают 10 - 30 мин водопроводной, затем дистиллированной водой.

11. Дифференцируют до просветления в растворе перманганата калия (2 - 3 кристалла на 50 мл дистиллированной воды + 1 капля серной кислоты).

12. Не промывая срезы, погружают их в 1 % раствор щавеле­вой кислоты на 1 - 3 мин (щавелевая кислота отмывает перманганат калия).

13. Промывают дистиллированной водой и переносят в спирты восходящей концентрации (50 %, 70 %, 96 %, 100 %) по 2 -3 мин.

14. Проводят через карбол-ксилол 1-2 мин, 2 - 3 порции ксилола и заключают.

Результат: фон препаратов светлый, тела нейронов и дендриты светло-серого цвета. Аксонные синаптические окончания импрегнируются интенсивно, дендриты - более интенсивно.

==========================================================

Методы Бильшовского

Предварительной обработкой материала для выявления нейрофибрилл, по Бильшовскому, служит фиксация нейтральным формалином. Оптимальная ее продолжительность - 3 - 6 нед после помещения в формалин, однако материал, лежавший в формалине несколько лет, также дает удовлетворительные результаты, особенно после обработки пиридином. Проводят окраску срезов (импрегнация срезов) или кусочков (тотальная импрегнация). Для получения хороших результатов необходимы точное соблюдение прописей (инструменты только стеклянные!) и применение чистых реактивов.

Импрегнация срезов

Материал фиксируют в растворе формалина (1:9) не менее 14 дней (максимальная толщина кусочков 1 см); промывают в проточной воде 2 -3 ч, затем в дистиллированной воде 1-2 дня; нарезают на замораживающем микротоме срезы толщиной.5 - 10 мкм и собирают в дистиллированную воду. Хорошие срезы вылавливают и промывают 1 - 2 раза в дистиллированной воде, которую меняют 3 - 4 раза.

Импрегнация:

1) срезы помещают в 2 % раствор нитрата серебра на 24 ч;

2) быстро (2 - 3 с) проводят через дистиллированную воду, сменяя стеклянные палочки;

3) помещают в свежеприготовленный раствор аммиачного се­ребра: к 10 мл 10 % раствора нитрата серебра добавляют 5 капель 40 % раствора гидроксида натрия - образуется коричнево-черный осадок окиси серебра. После этого при постоянном взбалтывании к раствору серебра по каплям добавляют раствор аммиака (молекулярная масса 0,875 - 0,910) до тех пор, пока от растворяющегося осадка останется лишь несколько крупинок. После каждой капли выжидают 10 - 20 с, прежде чем добавить следующую каплю. Необходимо избегать избытка аммиака. Раствор разводят до 20 мл дистиллированной водой. В раствор аммиачного серебра срезы помещают на 10 - 20 мин, в нем они должны приобрести желтоватый оттенок;

4) быстро проводят через 2 - 3 порции дистиллированной воды;

5) восстанавливают в растворе формалина (1:4), не содержащем кислоты в течение 10 мин, - срезы быстро окрашиваются в темно-серый цвет;

6) промывают в воде 15 мин;

7) золотят в разбавленном растворе трихлорида золота (3 - 5 капель 1 % раствора желтого трихлорида золота на 10 мл дистиллированной воды) до тех пор, пока коричневый тон не перейдет в серый или серо-фиолетовый;

8) фиксируют 1-2 мин в 5 % растворе тиосульфата натрия;

9) тщательно промывают в обычной воде (1-2 ч); проводят через спирты, карбол-ксилол, ксилол (не дольше, чем нужно) и заключают в бальзам.

На хорошо импрегнированных препаратах нейрофибриллы и перицеллюлярные сетчатые структуры ганглиозных клеток черного цвета выделяются на светлом фоне, так же отчетливо видны тончайшие осевые цилиндры.

К восстанавливающему 4 % раствору формалина можно добавить 1 % цитрат натрия в соотношении 1:9. В этом случае картина, получающаяся в результате серебрения, очень равномерная и более контрастная.

==========================================================

Метод серебрения с предварительной обработкой пиридином

В тех случаях, когда материал предназначается главным образом для выявления осевых цилиндров, а не внутриклеточных нейрофибрилл, М. Бильшовский рекомендует предварительно обработать его пиридином (благодаря этому сильно подавляется подкраска глии и соединительной ткани). Фиксацию и предварительную подготовку материала проводят по методу Бильшовского. Замороженные срезы промывают в дистиллированной воде 1 - 2 ч и переносят в неразведенный пиридин на 24- 48 ч. Затем срезы тщательно освобождают от пиридина, промывая их в часто сменяемой дистиллированной воде до тех пор, пока не исчезнет специфический запах пиридина. После этого переносят в 2 % раствор нитрата серебра на 24 ч и далее обрабатывают по методу Бильшовского.

Тотальная импрегнация

Импрегнацию целого кусочка проводят с предварительной обработкой пиридином или без нее. В последнем случае кусочки ткани размером не более 1 см3 фиксируют в формалине и без промывания переносят в 2 % раствор нитрата серебра на 1 - 8 дней (в зависимости от величины). Затем перекладывают на 0,5 - 6 ч в раствор аммиачного серебра, быстро проводят через дистиллированную воду и помещают в 20 % раствор формалина на 12 -24 ч. После этого материал как можно быстрее заливают в парафин.

Более надежной является тотальная импрегнация с пиридином по Билшовскому.

1. Органы, фиксированные не менее 1 нед в нейтральном формалине (от 1:4 до 1:9), разрезают на кусочки толщиной не более 0,5 см и на 3 - 4 дня помещают в чистый неразведенный пиридин при комнатной температуре.

2. Промывают 12 - 24 ч в проточной воде и столько же в часто сменяемой дистиллированной воде.

3. Пропитывают в 3 % растворе нитрата серебра при 36 °С 3 - 5 дней.

4. Быстро ополаскивают в дистиллированной воде.

5. Помещают на 24 ч в раствор аммиачного серебра (готовят так же, как для импрегнации срезов, но доливают дистиллированной водой до 100 мл).

6. Промывают в часто сменяемой воде (по Билшовскому до 1 ч в зависимости от толщины блока, по Буке, 2 ч).

7. Восстанавливают в нейтральном формалине (1:9) 10 - 12 ч.

8. Ополаскивают в дистиллированной воде, быстро проводят через спирты, заливают в парафин; золочение и фиксацию проводят на срезах.

При тотальной импрегнации с применением пиридина можно использовать материал, находившийся в формалине в течение нескольких лет. При этом методе глия и соединительная ткань обычно отступают на задний план или выделяются благодаря иному тону окраски. Фибриллярные структуры ганглиозных клеток выявляются менее четко, чем при использовании оригинального метода, моторные и чувствительные концевые образования нервов, наоборот, видны отчетливо.

Нередко импрегнация протекает хорошо не во всем кусочке, а лишь в его определенных зонах. Более благоприятные результаты наблюдаются в эмбриональных тканях, которые легче пропитываются.

М. Бильшовский рекомендует использовать для восстановления серебра не формалин, а смесь, состоящую из 75 мл 30 % раствора фруктозы, 75 мл 10 % раствора сегнетовой соли, 20 мл 10 % раствора карбоната калия и 5 мл чистого формалина. Импрегнированные блоки помещают в эту смесь на 24 ч при 50 °С. Затем следуют промывание в дистиллированной воде, обезвоживание и заливка.

Смесь может быть применена и для восстановления импрегнированных срезов. В этом случае срезы после пропитывания в растворе аммиачного серебра быстро ополаскивают и переносят на 1 - 2 мин в указанный раствор, подогретый до 50 °С. Затем следуют промывание, золочение и т.п.

С помощью восстанавливающей смеси по Бильшовскому особенно хорошо выявляются перицеллюлярные концевые образования в ЦНС.

==========================================================

Метод Адэра и Витгилию

(для выявления нейрофибрилл и синапсов)

Головной мозг кошки фиксируют в дважды сменяемом ацетоне по 24 ч в каждом. Заливают в парафин в течение 18 - 24 ч. Срезы толщиной 15-20 мкм депарафинируют, промывают в 100 % спирте и опускают на 6 ч в 1 % раствор аммиака на абсолютном спирте. Затем погружают на 6 ч в пиридин. Промывают в дистиллированной воде и переносят в 2 % раствор нитрата серебра на 12 ч при температуре 30 °С, затем промывают в 100 % спирте. Восстанавливают серебро в растворе пирогалловой кислоты с формалином (95 мл 95 % спирта, 3 г пирогалловой кислоты и 8 мл формалина).

Для усиления окраски срезы обрабатывают 3 - 4 мин в 1 % растворе щавелевой кислоты. Снова промывают в 6-8 порциях дистиллированной воды и погружают на 5-10 мин в 10 % раствор тиосульфата натрия. Далее промывают, обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилолах и заключают в бальзам.

Результат: хорошо выражены нейрофибриллы черного цвета, видны конечные колечки и колбочки.

==========================================================

Методы Рамон-и-Кахаля

Методы импрегнации нейрофибрилл, предложенные S. Ramon y Cajal, применяют преимущественно в форме тотальной импрегнации. Принцип методов основан на том, что свежевзятые кусочки ткани сразу или после фиксации спиртом пропитывают раствором нитрата серебра, а образовавшиеся при этом соединения серебра восстанавливают при последующей обработке пирогалловой кислотой или гидрохиноном.

Недостаток методов состоит в том, что в импрегнированном кусочке пригодной для исследования обычно оказывается лишь средняя зона, так как раствор серебра не проникает в глубокие слои. Наружная зона не может быть исследована вследствие сильного зачернения. Кроме того, часто происходит значительное сжатие ткани, в связи с чем общая сохранность препарата во многих случаях оказывается не очень хорошей. В новых модификациях метода импрегнации на срезах эти недостатки устраняются.

В растворах серебра препараты должны находиться все время в отсутствие света (коричневые склянки с пришлифованными пробками, обертки из картона и т.п.). Кусочки ткани не должны быть толще 3 мм.

Метод I.

Пригоден для исследования головного мозга мелких животных, а также эмбрионов и новорожденных крупных животных, позволяет выявить пирамидные клетки большого мозга и клетки-зерна мозжечка.

1. Свежевзятые кусочки ткани помещают на 3 - 5 дней в 0,75 - 3 % раствор нитрата серебра при 35 °С до появления табачно-коричневой окраски кусочков.

2. Ополаскивают дистиллированной водой 1 мин.

3. Восстанавливают 24 ч в смеси, состоящей из 1 - 2 г пирогалловой кислоты или гидрохинона, 5 мл нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды.

4. Ополаскивают в дистиллированной воде 5 мин.

5. Заливают в целлоидин или парафин.

Обезвоживать следует по возможности быстро, около 5-6 ч.

Для обработки материала, взятого у новорожденных и эмбрионов, берут 0,75 % раствор нитрата серебра, у взрослых млекопитающих-3 %, у беспозвоночных-6 % раствор. На 2-3 кусочка расходуют 80-100 мл раствора.

Метод II.

Пригоден для выявления мякотных и безмякотных нервных волокон, перицеллюлярных разветвлений, больших и средних нервных клеток, особенно головного мозга, мозжечка, спинного мозга и, кроме того, двигательных и чувствительных нервных окончаний и регенерационных стадий.

1. Материал фиксируют в 96 % или 100 % спирте 24 ч.

2. Разрезают на кусочки толщиной 2,5-3 мм, импрегнируют 5-7 дней в 1-1,5 % растворе нитрата серебра при 30-35 °С.

3. Ополаскивают дистиллированной водой 1 мин.

4. Восстанавливают 24 ч в смеси, состоящей из 1-2 г пирогалловой кислоты или гидрохинона, 5 мл нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды.

5. Ополаскивают дистиллированной водой 5 мин.

6. Заливают в парафин или целлоидин; обезвоживать следует по возможности быстрее (примерно 5-6 ч).

В том случае, если импрегнация слишком светлая, срезы 5 - 10 мин обрабатывают в смеси, состоящей из 3 г тиоцианата аммония. 3 г тиосульфата натрия, 100 мл дистиллированной воды и нескольких капель 1 % раствора трихлорида золота. Если к спирту, используемому для фиксации, добавить веронал, хлоралгидрат и т.п. (на 50 мл 1 г), то для импрегнации в растворе нитрата серебра потребуется только 5 дней. Это делает метод более надежным, и он может быть применен на материале, долгое время лежавшем в спирте.

Метод III.

Особенно показан для выявления нейрофибрилл спинного мозга, чувствительных симпатических ганглиев человека, кошки, собаки, кролика.

Материал фиксируют 24 ч в смеси 50 мл 96 % или 100 % спирта и 1-12 капель (для большого мозга 1-3 капли, моз­жечка-4, спинного и продолговатого мозга-8-12, периферических окончаний - 2 -3) раствора аммиака (молекулярная масса 0,910). Если аммиака добавлено слишком много, то импрегнация получается бледная. Сжатие можно уменьшить, если объект вначале поместить на 6 ч в 70 % спирт, затем на 2-4 ч в 85 % спирт и лишь после этого перенести в аммиачный спирт. После обсушивания фильтровальной бумагой обработку проводят так же, как при использовании метода II.

Метод IV.

Пригоден для выявления безмякотных волокон ЦНС, перицеллюлярных разветвлений, моховидных волокон мозжечка.

Материал фиксируют в смеси 15 мл формалина и 85 мл воды; промывают в проточной воде 6 - 12 ч; помещают на 24 ч в 50 мл 96 % спирта, к которому добавлено 5 капель раствора аммиака; обсушивают фильтровальной бумагой; далее обработку проводят так же, как при использовании метода II.

Метод V.

Хорошие результаты получают на эмбрионах, а у взрослых прежде всего при изучении нейрофибрилл, нервных окончаний и процесса регенерации нервов (за исключением первых стадий).

Материал фиксируют 24 ч в 70 % пиридине или смеси, состоящей из 40 частей пиридина и 30 частей 95 % спирта; промывают в проточной воде до исчезновения запаха 12-24 ч; переносят на 6-12 ч в 95 % спирт; далее обработку ведут так же, как при использовании метода II.

Метод VI.

Пригоден для изучения двигательных концевых пластинок, перицеллюлярных разветвлений, мозжечка.

Материал фиксируют 24 ч в смеси, состоящей из 5 г хлоралгидрата, 25 мл 100 % спирта и 75 мл дистиллированной воды; ополаскивают в дистиллированной воде 1 мин; помещают на 24 ч в 50 мл 100 % спирта, в который добавлено 4 капли раствора аммиака; промывают 12 - 24 ч в проточной воде и 2 - 5 ч в часто сменяемой дистиллированной воде; далее обработку ведут так же, как при использовании метода II.

Метод Рамона-Лермитта

(выявление дегенерированных синапсов)

Материал фиксируют в 10 % нейтральном формалине в течение 1-2 нед или дольше. Затем его переносят на 1 ч в 40 % формалин, 2 ч промывают в проточной воде и 2 ч -в дистиллированной. Срезы толщиной 15 - 20 мкм получают на замораживающем микротоме. Из дистиллированной воды их переносят в 20 % раствор нитрата серебра при температуре 50 - 53 °С (продолжительность пребывания в этом растворе срезов спинного мозга - 50 мин, продолговатого мозга и коры головного мозга - 60 мин, мозжечка и таламуса - 80 мин). После импрегнации срезы должны быть табачного цвета.

1. Срезы ополаскивают в дистиллированной воде, на 5-10 мин переносят в раствор аммиачного серебра (в 20 % раствор нитрата серебра добавлять по каплям 25 % раствор аммиака до растворения осадка в мерном стаканчике, а затем добавляют столько же раствора аммиака).

2. Промывают в дистиллированной воде.

3. Восстанавливают в формалине (1 часть формалина, 2 части водопроводной воды и 2 части дистиллированной воды) 15 мин, срезы должны стать коричнево-черными.

4. Переносят в 0,5 % раствор трихлорида, золота и держат до тех пор, пока срезы не станут серыми.

5. Закрепляют в 3 % растворе тиосульфата натрия 5 мин.

6. Промывают в дистиллированной воде (2 - 3 смены)

7. Обезвоживают в 40 % и 96 % спирте по 10 мин.

8. Просветляют в 10 % карбол-ксилоле и 2 смесях ксилола по 10 мин, заключают в бальзам.

==========================================================

Методика Бильшовского

(выявление внутриклеточных нейрофибрилл,

МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ ГЛИИ

Методика Снесарева

(выявление волокнистой, астроцитарной глии и глиальных волокон)

Методика высокоизбирательна, позволяет выявить астроциты белого вещества ЦНС, глиальные волокна, а в нервных клетках - феномен центральной тинкториальной ацидофилии (ЦТА) и одновременно бета-зернистость [Снесарев П.Е., 1950]. Преимущество методики Снесарева перед методикой Рамон-и-Кахаля заключается в получении дифференцированной окраски органелл астроцитов (цитоплазма, ядро, отростки). Дополнительно выявляют эритроциты в сосудах и дренажную снесаревскую олигодендроглию.

Материал фиксируют в 10 % формалине.

Срезы толщиной 8- 10 мкм получают на замораживающем микротоме.

1. Ополаскивают срезы в 2 сменах дистиллированной воды и помещают в профильтрованный 1 % водный раствор эритрозина (1 г эритрозина на 100 мл дистиллированной воды) на 20 - 30 с (в зависимости от восприимчивости красителя).

2. Срезы тщательно промывают в 2 и более сменах дистиллированной воды до прекращения отхождения краски.

3. Переносят в 0,5 % раствор фосфорно-молибденовой кислоты на 35 -40 с.

4. Быстро промывают в дистиллированной воде, переносят на предметное стекло, смазанное смесью белка и глицерина, тщательно протирают мягкой тканью стекло вокруг среза, промокают сложенной в 4 раза фильтровальной бумагой, а затем смоченной метилхлороформом (1 часть метилового спирта + 2 части хлороформа).

5. Стекла со срезами помещают в раствор Мая-Грюнвальда на 3 - 5 с.

6. Промывают в водопроводной воде в течение 3 - 5 с до удаления излишка красителя, протирают стекло тканью и промокают фильтровальной бумагой.

7. Обезвоживают в ацетоне, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам под покровное стекло.

Для приготовления 0,5 % раствора фосфорно-молибденовой кислоты на 200 мл дистиллированной воды берут 1 г фосфорно-молибденовой кислоты, взбалтывают. В полученном растворе имеется осадок. Раствор помещают на 2 - 3 ч в термостат при 37 - 40 °С, пока осадок не растворится (раствор должен быть абсолютно прозрачным).

Результат: на нежно-голубовато-синеватом фоне определяются такого же оттенка астроциты (ядро, цитоплазма, отростки). Вследствие патологических изменений астроцитарная клетка может настолько измениться, что патоморфоз в виде амебоидного астроцита бывает не всегда ясен. Ядра дренажной олигодендроглии в белом веществе также имеют светло-синеватую окраску, иногда с розоватым оттенком (метахромазия). Феномен центральной тинкториальной ацидофилии принадлежит к гистохимическим реакциям, при этом центральная часть клетки - ядро и прилежащая цитоплазма,- становится розовой: от ярко­го цвета до едва заметного розоватого оттенка. Эритроциты в сосудах розового цвета.

Следует иметь в виду, что фосфорно-молибденовая кислота и метилхлороформ могут пережечь ткань (появляется дырчатость), излишек эритрозина обусловливает появление розовых пятен, при излишке раствора Мая - Грюнвальда и чрезмерной толщине срезов (более 8-10 мкм) срез становится грубым и тонкая структура астроцитов плохо дифференцируется.

==========================================================

Методика Рамон-и-Кахаля

(выявление волокнистой и астроцитарной глии)

Материал фиксируют в 10 % формалине. Срезы толщиной 8 - 10 мкм получают на замораживающем микротоме, хранят в свежем 10 % кислом формалине.

1. Срезы промывают в 3 сменах дистиллированной воды и переносят на 2 сут в свежий бромистый фиксатор (14 мл нейтрального формалина, 2 г бромида аммония и 100 мл дистиллированной воды).

2. Тщательно промывают в 3 сменах дистиллированной воды и переносят в раствор трихлорида золота с сулемой (8 мл 5 % прозрачного раствора сулемы, 10 мл 1 % раствора трихлорида золота и 60 мл дистиллированной воды) на 1 сут в темное место.

3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды и помещают в 5 % раствор тиосульфата натрия на 1 мин.

Нейрон в норме не делится, однако способен к восстановлению, причем восстановление обеспечивается нейроглией.

При повреждении нейрон, как правило, погибает и фагоцитируется («пожирается») микроглиальными клетками.

Если повреждается отросток нейрона, то разворачивается следующая цепь событий: начинается хроматолиз - разрушение и растворение вещества Ниссля, содержащегося внутри нейрона. Одновременно теряется вода, нейрон уменьшается в размерах, а дистальная часть перерезанного отростка распадается, т.е. Шванновские клетки отходят, а миелин растворяется – эта реакция в целом носит название первичной реакции Ниссля и представляет собой первичную дегенерацию .

На следующей стадии во время вторичной (Веллеровской) дегенерации периферический отрезок, потерявший связь с телом нейрона, распадается, однако Шванновские клетки образуют синцитий в виде лент, которые можно назвать пустыми «рукавами». «Рукава» обозначают бывшее место расположения отростка. Такие ленты называют Бюнгеровыми тяжами.

После этого начинается регенерация. На центральных концах отрезанных аксонов образуются утолщения – колбы роста. В этих колбах происходит наращивание аксона вдоль по Бюнгеровому тяжу вплоть до старой точки иннервации.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ НЕРВНОЙ ТКАНИ

Прежде чем подвергать нервную ткань гистологическому анализу, необходимо подготовить препарат, т.е. правильно взять материал и зафиксировать. Как правило, исследуется нервная ткань умерших организмов. И самый распространенный способ изучения – это способ с предварительной окраской. Окраска обуславливается свойством некоторых металлов образовывать на телах или отростках нейронов соединения, которые при действии восстановителя дают черный либо другой цвет.

Вещество Ниссля выявляется окраской метиленовым синим . Используют люминесцентную микроскопию с предварительным введением раствора трипафлавина , который создает красное свечение безмякотных волокон и зеленоватую флюоресценцию мякотных.

Для фиксации нервной ткани перед окраской используют 10-20% раствор формалина , большие куски (головной мозг) помещают на 24 часа в 5% формалина на физиологическом растворе (NaCl), после чего переносят в 10% раствор формалина. После этого вырезаются необходимые кусочки и выдерживаются либо в свежем формалиновом растворе, либо в др. фиксаторах (спирт, суржа, др.).

Некоторые методы предполагают первоначальную фиксацию в смеси формалина с бромистым аммоминием , либо в смеси спирта и аммиака. Используется также хлороформ, двухромовокислый калий, азотная кислота.

В дальнейшем кусочки мозга заливают в парафиновые блоки с помощью которых изготавливают микросрезы толщиной до 120 мкм. Готовые срезы наклеивают на предметное стекло и приступают к окраске. Осаждение солей металлов на клеточных мембранах делает их видимыми. Применяют также метод замороженных срезов, высушивания. Препараты можно окрашивать гематоксилином , эозином , пикрофуксином , хромовой кислотой , тионином , толуидиновым синим , крезиловым фиолетовым , галлоцианином , серебром , свинцом , золотом , молибденом , осмиевой кислотой .

Домашнее задание 2-й лекции.

1. Дайте схематическое изображение морфологических типов нейронов, подпишите составляющие элементы, и укажите структурную принадлежность данных типов.

2. Зарисуйте схему центральной части фронтального среза головы и обозначьте защитные структуры головного мозга.

ЛЕКЦИЯ О РАЗВИТИИ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ

ФИЛОГЕНЕЗ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ

Филогенез – это постепенное развитие форм органического мира в процессе эволюции.

Простейшие одноклеточные не имеют нервных систем, поэтому все их реакции являются результатом деятельности одной клетки. У многоклеточных появляются отдельные нервные клетки, задача которых быстро распознать угрожающий внешний фактор и передать сигнал тем клеткам, которые могут защитить организм (мышечные, стрекательные, прочие). Такой тип нервной системы называется диффузным или сетевидным. Она способна воспринимать раздражение любых участков тела и посылать импульсы другим клеткам. Появление в эволюции диффузной нервной системы давало животным преимущество в борьбе за выживание, так как такие животные быстрее спасались от хищников и быстрее охотились сами.

С течением времени наблюдалась концентрация - рассеянные нервные клетки стали располагаться ближе друг к другу, возникали узлы и общие тракты, в результате этого сформировался узловой тип нервной системы. Узловая нервная система – это такая система нервных клеток, которая характеризуется их концентрацией в центры (узлы) с отходящими нервными стволами. Посегментно расположенные ганглии служат центрами иннервации соответствующих сегментов тела у животных. В головном конце тела располагаются надглоточные крупные узлы – прообраз головного мозга позвоночных животных.

Следующий этап состоит в том, что нейроны сгруппированы не только в отдельные нервные узлы, но даже в продолговатый непрерывный нервный тяж – внутри которого имеется полость – это трубчатая нервная система .

Нервная трубка характерна для хордовых – у нее выделяют два отдела: головной и спинной. Из туловищного отдела выходят многочисленные корешки (у человека это корешки спинномозговых нервов).

В соответствии с метамерностью тела хордовых животных единая трубчатая нервная система состоит из ряда однотипных повторяющихся структур, или сегментов.

В головном конце нервной трубки в связи с развивающимися в передних отделах туловища органов чувств сегментарное строение нервной трубки хотя и сохраняется, но претерпевает изменения. Эти отделы нервной трубки являются зачатком, из которого развивается головной мозг.

Развитие головного мозга происходит параллельно с усовершенствованием спинного мозга, причем появление новых центров в головном мозге ставит как бы в подчиненное положение уже существующие центры спинного мозга. В головном отделе нервной трубки (головном мозге) возникали новые вспомогательные нейроны и передний отдел трубки разрастался (цефализация ). Более старые н6ервные центры, сформировавшиеся на ранних этапах эволюции, не исчезают, а сохраняются, занимая подчиненное положение по отношению к более новым.

Далее в прогрессивном развитии организма шло количественное изменение: общий рост нервной трубки. Однако, было приобретено и новое качество - полушария переднего мозга и развитие коры, где возникают новые регуляторные центры, подчиняющие себе нервные центры низшего порядка, координируют их деятельность, объединяя нервную систему в структурное и функциональное целое. Такой процесс был назван кортиколизацией функций.

Параллельно с развитием конечного мозга шло развитие (усложнение и дифференцировка) всех других отделов мозга, перестройка восходящих и нисходящих нервных трактов. В спинном мозге формировались два небольших утолщения (шейное и поясничное). Эти два утолщения содержат нейроны, функции которых управление конечностями, причем шейное утолщение более мощное.

Эволюция головного мозга проявилась в развитии и совершенствовании рецепторного аппарата, усовершенствовании механизмов приспособления организма к окружающей среде путем изменения обмена веществ, кортиколизации функций.

ОНТОГЕНЕЗ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ

Онтогенез – это постепенное развитие организма или его части от момента зарождения до смерти.

Нервная система человека развивается из эктодермы в дорсальном отделе туловища зародыша, где эктодермальные клетки образуют нервную (медуллярную) пластинку. Медуллярная пластинка сначала однослойная, позже в ней появляются спонгиобласты (предшественники нейроглии) и нейробласты (предшественники нейронов). Эти клетки делятся, нервная пластинка разрастается. В боковых ее частях деление происходит более интенсивно, поэтому она прогибается, на ней появляются валики, в результате чего нервная пластинка становится нервным желобком , в дальнейшем валики смыкаются и появляется нервная трубка , после сращения валиков нервная трубка отшнуровывается от эктодермы и погружается в мезодерму.

Медуллярная (нервная) трубка в период замыкания состоит из трех слоев. Из внутреннего слоя нервной трубки развивается эпендимная выстилка центрального канала, из среднего слоя развивается серое вещество, из наружного - белое.

Нервная трубка растет в длину, в ширину, кроме этого некоторые клетки выселяются (клетки зачатков глаз).

Уже у 4-х недельного эмбриона есть головной «пузырный» мозг. На первом этапе головной мозг состоит из трех пузырей (ромбовидный, средний, передний мозг). В дальнейшем, после дифференцировки переднего и ромбовидного пузырей выделяется пять пузырей (конечный мозг, промежуточный мозг, средний мозг, задний мозг и продолговатый мозг).

Спинной мозг плода в первые 3 месяца внутриутробного развития по длине равен позвоночному каналу, однако, позвоночник растет быстрее, чем спинной мозг, в результате чего формируется «конский хвост». «Конский хвост» – представляет собой совокупность спинномозговых нервов, соединяющих сегменты спинного мозга с соответствующими им межпозвонковыми отверстиями.

Нервная трубка у четырехнедельного эмбриона, характеризуется не только наличием пузырей, но и изгибами в сагиттальной плоскости – эти изгибы служат границами отделов мозга: часть изгибов обращены вентрально, а часть - дорсально. Пятипузырный головной мозг характеризуется разрастанием отделов латерально (например: из промежуточного головного мозга латерально выпячиваются глазничные пузырьки).

Рассмотренный путь развития влияет на рисунок центрального мозгового канала: в ЦНС центральный спинномозговой канал соединяется системой желудочков головного мозга.

К моменту рождения в ЦНС имеется головной мозг с отделами: продолговатый мозг, Варолиев мост, мозжечок, средний мозг, промежуточный мозг и передний мозг.

Передний мозг содержит первый и второй мозговые желудочки . Между буграми таламуса в промежуточном мозге располагается третий желудочек, который через Сильвиев водопровод соединяется с четвертым желудочком, расположенным между мостом, продолговатым мозгом и мозжечком.

Домашнее задание 3-й лекции

1. Дайте схематическое изображение основных типов нервной системы в эволюции и приведите примеры животных, имеющих соответствующую организацию.

2. Зарисуйте схематические изображения ЦНС человека на последовательных этапах эмбриогенеза, указав сроки и размеры эмбриона, и обозначьте формирующиеся структуры.

ЛЕКЦИЯ О СПИННОМ МОЗГЕ

Спинной мозг взрослого человека – это цилиндрический тяж, длиной 40-45 см, массой около 34-38 г и диаметром 1.5 см, расположенный в спинномозговом канале позвоночника на протяжении от большого затылочного отверстия черепа до второго поясничного позвонка, далее продолжается в виде конского хвоста, заканчивается терминальной (концевой) нитью.

Конский хвост состоит из спинномозговых нервов, лежащих ниже первого поясничного сегмента спинного мозга. Концевая (терминальная) нить образована только оболочками спинного мозга.

У спинного мозга имеются два утолщения :

1. шейное (от II шейного до II грудного позвонка),

2. поясничное (от X грудного до I поясничного позвонка), переходящее в мозговой конус.

В этих зонах число нервных клеток увеличено в связи с тем, что здесь берут начало нервы, иннервирующие конечности.

В вентральной части спинного мозга располагается передняя срединная щель, сзади - задняя срединная борозда, а по бокам - передние и задние боковые борозды. Борозды делят каждую половинку спинного мозга на три кнатика.

Из боковых борозд выходит двойной ряд пучков нервных волокон – корешков спинномозговых нервов (СМН). Передний корешок образуется аксонами двигательных нейронов передних рогов серого вещества спинного мозга. Задний корешок образован аксонами чувствительных нейронов спинномозговых ганглиев.

В спинном мозге выделяют 31 сегмент:

§ 8 шейных (сегменты С 1 -С 8),

§ 12 грудных (сегменты Т 1 -Т 12),

§ 5 поясничных (сегменты L 1 -L 5),

§ 5 крестцовых (сегменты S 1 -S 5),

§ 1 копчиковый (сегменты Со 1).

Количество сегментов не совпадают с количеством позвонков.

От спинного мозга отходят 31 пара СМН, то есть 124 корешка. Счет идет следующим образом: в спинном мозге 31 сегмент (62 спинномозговых нерва), каждый нерв состоит из двух корешков (124).

Таким образом, сегмент спинного мозга – это его часть с отходящими от него двумя СМН (или четырьмя корешками).

Начиная с четырех месяцев внутриутробного развития человека позвоночник обгоняет в росте спинной мозг. Этот процесс заканчивается вместе с ростом человека и в результате спинной мозг заканчивается на уровне второго поясничного позвонка, соответственно первый грудной сегмент лежит на уровне седьмого шейного позвонка, первый поясничный сегмент - на уровне десятого грудного позвонка, первый крестцовый сегмент – на уровне первого поясничного позвонка, первый шейный сегмент находится между первым шейным позвонком и черепом.

На поперечном разрезе спинного мозга видно и серое и белое вещество. В центре спинного мозга проходит центральный канал, остаток просвета нервной трубки.

СТРОЕНИЕ СЕРОГО ВЕЩЕСТВА

На горизонтальном разрезе спинного мозга серое вещество по форме напоминает букву «Н» или бабочку. Здесь выделяют передние, задние и боковые рога.

Боковые рога имеются только с первого грудного по третий поясничный сегмент, в них лежат тела преганглионарных симпатических нейронов. В шейных сегментах и верхних грудных сегментах между передними рогами имеются тонкие перекладины серого вещества – сетчатое образование спинного мозга.

Передние рога содержат тела двигательных нейронов – аксоны, которые выходя из передней латеральной борозды образуют передние корешки.

Задние рога содержат тела вставочных нейронов. На верхушках задних рогов различают студенистое вещество , которое состоит из тел вставочных нейронов, соединяющих своими отростками различные сегменты спинного мозга.

СТРОЕНИЕ БЕЛОГО ВЕЩЕСТВА

Белое вещество– образовано миелинизированными отростками нейронов – афферентными (восходящими) и эфферентными (нисходящими). Эти волокна образуют проводящий аппарат спинного мозга. С каждой стороны белое вещество делится на три канатика (задний, боковой, передний).

Похожая информация.

Содержание статьи

ГИСТОЛОГИЯ, наука, занимающаяся изучением тканей животных. Тканью называют группу клеток, сходных по форме, размерам и функциям и по продуктам своей жизнедеятельности. У всех растений и животных, за исключением самых примитивных, тело состоит из тканей, причем у высших растений и у высокоорганизованных животных ткани отличаются большим разнообразием структуры и сложностью своих продуктов; сочетаясь друг с другом, разные ткани образуют отдельные органы тела.

Гистология изучает ткани животных; исследование растительных тканей обычно относят к анатомии растений. Гистологию иногда называют микроскопической анатомией, поскольку она изучает строение (морфологию) организма на микроскопическом уровне (объектом гистологического исследования служат очень тонкие тканевые срезы и отдельные клетки). Хотя эта наука прежде всего описательная, в ее задачу также входит интерпретация тех изменений, которые происходят в тканях в норме и патологии. Поэтому гистологу необходимо хорошо разбираться в том, как формируются ткани в процессе эмбрионального развития, какова их способность к росту в постэмбриональный период и каким они подвергаются изменениям в различных естественных и экспериментальных условиях, в том числе в ходе своего старения и гибели составляющих их клеток.

История гистологии как отдельной ветви биологии тесно связана с созданием микроскопа и его совершенствованием. М.Мальпиги (1628–1694) называют «отцом микроскопической анатомии», а следовательно гистологии. Гистология обогащалась наблюдениями и методами исследования, проводившимися или создававшимися многими учеными, основные интересы которых лежали в области зоологии или медицины. Об этом свидетельствует гистологическая терминология, увековечившая их имена в названиях впервые описанных ими структур или созданных методов: островки Лангерганса, либеркюновы железы, купферовы клетки, мальпигиев слой, окраска по Максимову, окраска по Гимза и т.п.

В настоящее время получили распространение методы изготовления препаратов и их микроскопического исследования, дающие возможность изучать отдельные клетки. К таким методам относятся техника замороженных срезов, фазово-контрастная микроскопия, гистохимический анализ, культивирование тканей, электронная микроскопия; последняя позволяет детально изучать клеточные структуры (клеточные мембраны, митохондрии и др.). С помощью сканирующего электронного микроскопа удалось выявить интереснейшую трехмерную конфигурацию свободных поверхностей клеток и тканей, которую невозможно увидеть под обычным микроскопом.

Происхождение тканей.

Развитие зародыша из оплодотворенного яйца происходит у высших животных в результате многократных клеточных делений (дробления); образующиеся при этом клетки постепенно распределяются по своим местам в разных частях будущего зародыша. Первоначально эмбриональные клетки похожи друг на друга, но по мере нарастания их количества они начинают изменяться, приобретая характерные особенности и способность к выполнению тех или иных специфических функций. Этот процесс, называемый дифференцировкой, в конечном итоге приводит к формированию различных тканей. Все ткани любого животного происходят из трех исходных зародышевых листков: 1) наружного слоя, или эктодермы; 2) самого внутреннего слоя, или энтодермы; и 3) среднего слоя, или мезодермы. Так, например, мышцы и кровь – это производные мезодермы, выстилка кишечного тракта развивается из энтодермы, а эктодерма образует покровные ткани и нервную
систему.

Основные типы тканей.

Гистологи обычно различают у человека и высших животных четыре основных ткани: эпителиальную, мышечную, соединительную (включая кровь) и нервную. В одних тканях клетки имеют примерно одинаковую форму и размеры и так плотно прилегают одна к другой, что между ними не остается или почти на остается межклеточного пространства; такие ткани покрывают наружную поверхность тела и выстилают его внутренние полости. В других тканях (костной, хрящевой) клетки расположены не так плотно и окружены межклеточным веществом (матриксом), которое они продуцируют. От клеток нервной ткани (нейронов), образующих головной и спинной мозг, отходят длинные отростки, заканчивающиеся очень далеко от тела клетки, например в местах контакта с мышечными клетками. Таким образом, каждую ткань можно отличить от других по характеру расположения клеток. Некоторым тканям присуще синцитиальное строение, при котором цитоплазматические отростки одной клетки переходят в аналогичные отростки соседних клеток; такое строение наблюдается в зародышевой мезенхиме, рыхлой соединительной ткани, ретикулярной ткани, а также может возникнуть при некоторых заболеваниях.

Многие органы состоят из тканей нескольких типов, которые можно распознать по характерному микроскопическому строению. Ниже дается описание основных типов тканей, встречающихся у всех позвоночных животных. У беспозвоночных, за исключением губок и кишечнополостных, тоже имеются специализированные ткани, аналогичные эпителиальной, мышечной, соединительной и нервной тканям позвоночных.

Эпителиальная ткань.

Эпителий может состоять из очень плоских (чешуйчатых), кубических или же цилиндрических клеток. Иногда он бывает многослойным, т.е. состоящим из нескольких слоев клеток; такой эпителий образует, например, наружный слой кожи у человека. В других частях тела, например в желудочно-кишечном тракте, эпителий однослойный, т.е. все его клетки связаны с подлежащей базальной мембраной. В некоторых случаях однослойный эпителий может казаться многослойным: если длинные оси его клеток расположены непараллельно друг другу, то создается впечатление, что клетки находятся на разных уровнях, хотя на самом деле они лежат на одной и той же базальной мембране. Такой эпителий называют многорядным. Свободный край эпителиальных клеток бывает покрыт ресничками, т.е. тонкими волосовидными выростами протоплазмы (такой ресничный эпителий выстилает, например, трахею), или же заканчивается «щеточной каемкой» (эпителий, выстилающий тонкий кишечник); эта каемка состоит из ультрамикроскопических пальцевидных выростов (т.н. микроворсинок) на поверхности клетки. Помимо защитных функций эпителий служит живой мембраной, через которую происходит всасывание клетками газов и растворенных веществ и их выделение наружу. Кроме того, эпителий образует специализированные структуры, например железы, вырабатывающие необходимые организму вещества. Иногда секреторные клетки рассеяны среди других эпителиальных клеток; примером могут служить бокаловидные клетки, вырабатывающие слизь, в поверхностном слое кожи у рыб или в выстилке кишечника у млекопитающих.

Мышечная ткань.

Мышечная ткань отличается от остальных своей способностью к сокращению. Это свойство обусловлено внутренней организацией мышечных клеток, содержащих большое количество субмикроскопических сократительных структур. Существует три типа мышц: скелетные, называемые также поперечнополосатыми или произвольными; гладкие, или непроизвольные; сердечная мышца, являющаяся поперечнополосатой, но непроизвольной. Гладкая мышечная ткань состоит из веретеновидных одноядерных клеток. Поперечнополосатые мышцы образованы из многоядерных вытянутых сократительных единиц с характерной поперечной исчерченностью, т.е. чередованием светлых и темных полос, перпендикулярных длинной оси. Сердечная мышца состоит из одноядерных клеток, соединенных конец в конец, и имеет поперечную исчерченность; при этом сократительные структуры соседних клеток соединены многочисленными анастомозами, образуя непрерывную сеть.

Соединительная ткань.

Существуют различные типы соединительной ткани. Самые важные опорные структуры позвоночных состоят из соединительной ткани двух типов – костной и хрящевой. Хрящевые клетки (хондроциты) выделяют вокруг себя плотное упругое основное вещество (матрикс). Костные клетки (остеокласты) окружены основным веществом, содержащим отложения солей, главным образом фосфата кальция. Консистенция каждой из этих тканей определяется обычно характером основного вещества. По мере старения организма содержание минеральных отложений в основном веществе кости возрастает, и она становится более ломкой. У маленьких детей основное вещество кости, а также хряща богато органическими веществами; благодаря этому у них обычно бывают не настоящие переломы костей, а т.н. надломы (переломы по типу «зеленой ветки»). Сухожилия состоят из волокнистой соединительной ткани; ее волокна образованы из коллагена – белка, секретируемого фиброцитами (сухожильными клетками). Жировая ткань бывает расположена в разных частях тела; это своеобразный тип соединительной ткани, состоящий из клеток, в центре которых находится большая глобула жира.

Кровь.

Кровь представляет собой совершенно особый тип соединительной ткани; некоторые гистологи даже выделяют ее в самостоятельный тип. Кровь позвоночных состоит из жидкой плазмы и форменных элементов: красных кровяных клеток, или эритроцитов, содержащих гемоглобин; разнообразных белых клеток, или лейкоцитов (нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, лимфоцитов и моноцитов), и кровяных пластинок, или тромбоцитов. У млекопитающих зрелые эритроциты, поступающие в кровяное русло, не содержат ядер; у всех других позвоночных (рыб, земноводных, пресмыкающихся и птиц) зрелые функционирующие эритроциты содержат ядро. Лейкоциты делят на две группы – зернистых (гранулоциты) и незернистых (агранулоциты) – в зависимости от наличия или отсутствия в их цитоплазме гранул; кроме того, их нетрудно дифференцировать, используя окрашивание специальной смесью красителей: гранулы эозинофилов приобретают при таком окрашивании ярко-розовый цвет, цитоплазма моноцитов и лимфоцитов – голубоватый оттенок, гранулы базофилов – пурпурный оттенок, гранулы нейтрофилов – слабый лиловый оттенок. В кровяном русле клетки окружены прозрачной жидкостью (плазмой), в которой растворены различные вещества. Кровь доставляет кислород в ткани, удаляет из них диоксид углерода и продукты метаболизма, переносит питательные вещества и продукты секреции, например гормоны, из одних частей организма в другие.

Нервная ткань.

Нервная ткань состоит из высоко специализированных клеток – нейронов, сконцентрированных главным образом в сером веществе головного и спинного мозга. Длинный отросток нейрона (аксон) тянется на большие расстояния от того места, где находится тело нервной клетки, содержащее ядро. Аксоны многих нейронов образуют пучки, которые мы называем нервами. От нейронов отходят также дендриты – более короткие отростки, обычно многочисленные и ветвистые. Многие аксоны покрыты специальной миелиновой оболочкой, которая состоит из шванновских клеток, содержащих жироподобный материал. Соседние шванновские клетки разделены небольшими промежутками, называемыми перехватами Ранвье; они образуют характерные углубления на аксоне. Нервная ткань окружена опорной тканью особого типа, известной под названием нейроглии.

Замещение ткани и регенерация.

На протяжении всей жизни организма постоянно происходит изнашивание или разрушение отдельных клеток, что составляет один из аспектов нормальных физиологических процессов. Кроме того, иногда, например в результате какой-то травмы, происходит утрата той или иной части тела, состоящей из разных тканей. В таких случаях для организма крайне важно воспроизвести утраченную часть. Однако регенерация возможна только в определенных границах. Некоторые относительно просто организованные животные, например планарии (плоские черви), дождевые черви, ракообразные (крабы, омары), морские звезды и голотурии, могут восстанавливать части тела, утраченные целиком по каким-либо причинам, в том числе в результате самопроизвольного отбрасывания (аутотомии). Чтобы произошла регенерация, недостаточно одного лишь образования новых клеток (пролиферации) в сохранившихся тканях; новообразованные клетки должны быть способны к дифференцировке, чтобы обеспечить замену клеток всех типов, входивших в утраченные структуры. У других животных, особенно у позвоночных, регенерация возможна лишь в некоторых случаях. Тритоны (хвостатые амфибии) способны регенерировать хвост и конечности. Млекопитающие лишены этой способности; однако и у них после частичного экспериментального удаления печени можно наблюдать в определенных условиях восстановление довольно значительного участка печеночной ткани.

Более глубокое понимание механизмов регенерации и дифференцировки несомненно откроет много новых возможностей для использования этих процессов в лечебных целях. Фундаментальные исследования уже внесли большой вклад в развитие методов пересадки кожи и роговицы. В большинстве дифференцированных тканей сохраняются клетки, способные к пролиферации и дифференцировке, но существуют ткани (в частности, центральная нервная система у человека), которые, будучи полностью сформированными, не способны к регенерации. Примерно в годовалом возрасте центральная нервная система человека содержит положенное ей число нервных клеток, и хотя нервные волокна, т.е. цитоплазматические отростки нервных клеток, способны регенерировать, случаи восстановления клеток головного или спинного мозга, разрушенных в результате травмы или дегенеративного заболевания, неизвестны.

Классическими примерами замещения нормальных клеток и тканей в организме человека служит обновление крови и верхнего слоя кожи. Наружный слой кожи – эпидермис – лежит на плотном соединительнотканном слое, т.н. дерме, снабженной мельчайшими кровеносными сосудами, доставляющими ей питательные вещества. Эпидермис состоит из многослойного плоского эпителия. Клетки его верхних слоев постепенно трансформируются, превращаясь в тонкие прозрачные чешуйки – процесс, называемый ороговением; в конце концов эти чешуйки слущиваются. Такое слущивание особенно заметно после сильных солнечных ожогов кожи. У земноводных и пресмыкающихся сбрасывание ороговевшего слоя кожи (линька) происходит регулярно. Ежедневная утрата поверхностных клеток кожи компенсируется за счет новых клеток, поступающих из активно растущего нижнего слоя эпидермиса. Различают четыре слоя эпидермиса: наружный роговой слой, под ним – блестящий слой (в котором начинается ороговение, и его клетки при этом становятся прозрачными), ниже – зернистый слой (в его клетках накапливаются пигментные гранулы, что вызывает потемнение кожи, особенно под действием солнечных лучей) и, наконец, самый глубокий – зачатковый, или базальный, слой (в нем на протяжении всей жизни организма происходят митотические деления, дающие новые клетки для замены слущивающихся).

Клетки крови человека и других позвоночных тоже постоянно обновляются. Каждому типу клеток свойственна более или менее определенная продолжительность жизни, по истечении которой они разрушаются и удаляются из крови другими клетками – фагоцитами («пожирателями клеток»), специально приспособленными для этой цели. Новые кровяные клетки (взамен разрушившихся) образуются в кроветворных органах (у человека и млекопитающих – в костном мозге). Если потеря крови (кровотечение) или разрушение клеток крови под действием химических веществ (гемолитических агентов) наносят клеточным популяциям крови большой ущерб, кроветворные органы начинают продуцировать больше клеток. При потере большого количества эритроцитов, снабжающих ткани кислородом, клеткам тела угрожает кислородное голодание, особенно опасное для нервной ткани. При недостатке лейкоцитов организм теряет способность сопротивляться инфекциям, а также удалять из крови разрушившиеся клетки, что само по себе ведет к дальнейшим осложнениям. В нормальных условиях потеря крови служит достаточным стимулом для мобилизации регенеративных функций кроветворных органов.

Реакции тканей на аномальные условия.

При повреждении тканей возможна некоторая утрата типичной для них структуры в качестве реакции на возникшее нарушение.

Механическое повреждение.

При механическом повреждении (разрезе или переломе) тканевая реакция направлена на то, чтобы заполнить образовавшийся разрыв и воссоединить края раны. К месту разрыва устремляются слабо дифференцированные элементы тканей, в частности фибробласты. Иногда рана бывает так велика, что хирургу приходится вносить в нее кусочки ткани, чтобы стимулировать начальные стадии процесса заживления; для этого используют обломки или даже целые куски кости, полученные при ампутации и хранящиеся в «банке костей». В тех случаях, когда кожа, окружающая большую рану (например, при ожогах), не может обеспечить заживление, прибегают к пересадкам лоскутов здоровой кожи, взятых с других частей тела. Такие трансплантаты в некоторых случаях не приживляются, поскольку пересаженной ткани не всегда удается образовать контакт с теми частями тела, на которые ее переносят, и она отмирает или отторгается реципиентом.

Инородные объекты.

Давление.

Омозолелости возникают при постоянном механическом повреждении кожи в результате оказываемого на нее давления. Они проявляются в виде хорошо знакомых всем мозолей и утолщений кожи на подошвах ног, ладонях рук и на других участках тела, испытывающих постоянное давление. Удаление этих утолщений путем иссечения не помогает. До тех пор, пока давление будет продолжаться, образование омозолелостей не прекратится, а срезая их мы лишь обнажаем чувствительные нижележащие слои, что может привести к образованию ранок и развитию инфекции.

Методы изучения тканей.

Разработано множество специальных методов изготовления тканевых препаратов для микроскопического исследования. Существует также особый метод, называемый культурой тканей, позволяющий наблюдать и исследовать живые ткани.

Культура ткани.

Изолированные кусочки тканей или органов помещают в питательные растворы в условиях, исключающих возможность заражения микробами. В этой необычной среде ткани продолжают расти, проявляя многие особенности (такие, как потребность в питательных веществах, кислороде, определенном пространстве и т.п.), характерные для них в нормальных условиях, т.е. когда они находятся в живом организме. Культивируемые ткани могут сохранять и многие из своих структурных и функциональных признаков: фрагменты сердечной мышцы продолжают ритмически сокращаться, кожа зародыша продолжает расти и дифференцируется в обычном направлении. Однако иногда культивирование выявляет такие свойства ткани, которые у нее в обычных условиях не выражены и могли бы остаться неизвестными. Так, изучая строение клеток аномальных новообразований (опухолей), не всегда удается установить их принадлежность к той или иной ткани или их эмбриональное происхождение. Однако при выращивании в искусственной питательной среде они приобретают черты, характерные для клеток определенной ткани или органа. Это может оказаться чрезвычайно полезным не только для правильной идентификации опухоли, но и для установления органа, в котором она первоначально возникла. Некоторые клетки, например фибробласты (клетки соединительной ткани), очень легко поддаются культивированию, что делает их ценными экспериментальными объектами, в частности в тех случаях, когда необходим однородный материал для испытания новых лекарственных препаратов.

Выращивание тканевой культуры требует определенных навыков и оборудования, однако это важнейший метод изучения живых тканей. Кроме того, он позволяет получить дополнительные данные о состоянии тканей, изучавшихся обычными гистологическими методами.

Микроскопические исследования и гистологические методы.

Даже самый поверхностный осмотр позволяет отличить одни ткани от других. Мышечную, костную, хрящевую и нервную ткани, а также кровь можно распознать невооруженным глазом. Однако для детального исследования необходимо изучать ткани под микроскопом при большом увеличении, позволяющем увидеть отдельные клетки и характер их распределения. Под микроскопом можно исследовать влажные препараты. Пример такого препарата – мазок крови; для его изготовления наносят каплю крови на предметное стекло и размазывают по нему в виде тонкой пленки. Однако эти методы обычно не позволяют получить полную картину распределения клеток, а также участков, в которых ткани соединяются.

Живые ткани, извлеченные из тела, подвергаются быстрым изменениям; между тем любое самое незначительное изменение ткани ведет к искажению картины на гистологическом препарате. Поэтому очень важно сразу же после извлечения ткани из организма обеспечить ее сохранность. Это достигается с помощью фиксаторов – жидкостей различного химического состава, которые очень быстро убивают клетки, не искажая детали их строения и обеспечивая сохранение ткани в этом – фиксированном – состоянии. Состав каждого из многочисленных фиксаторов был разработан в результате многократного экспериментирования, и тем же способом многократных проб и ошибок было установлено нужное соотношение в них разных компонентов.

После фиксации ткань обычно подвергают обезвоживанию. Поскольку быстрый перенос в спирт высокой концентрации привел бы к сморщиванию и деформации клеток, обезвоживание производят постепенно: ткань проводят через ряд сосудов, содержащих спирт в последовательно возрастающей концентрации, вплоть до 100%. После этого ткань обычно переносят в жидкость, хорошо смешивающуюся с жидким парафином; чаще всего для этого используют ксилол или толуол. После кратковременного выдерживания в ксилоле ткань способна поглощать парафин. Пропитывание ведется в термостате, чтобы парафин оставался жидким. Всю эту т.н. проводку производят вручную или же помещают образец в специальный прибор, который проделывает все операции автоматически. Используется и более быстрая проводка с использованием растворителей (например, тетрагидрофурана), способных смешиваться как с водой, так и с парафином.

После того как кусочек ткани полностью пропитался парафином, его помещают в небольшую бумажную или металлическую форму и добавляют в нее жидкий парафин, заливая им весь образец. Когда парафин затвердеет, получается твердый блок с заключенной в нем тканью. Теперь ткань можно нарезать. Обычно для этого используют специальный прибор – микротом. Образцы тканей, взятые во время операции, можно нарезать, предварительно заморозив, т.е. не проводя обезвоживания и заливки в парафин.

Описанную выше процедуру приходится несколько модифицировать, если ткань, например кость, содержит твердые включения. Минеральные компоненты кости необходимо предварительно удалить; для этого ткань после фиксации обрабатывают слабыми кислотами – этот процесс называют декальцинированием. Наличие в блоке кости, не подвергшейся декальцинированию, деформирует всю ткань и повреждает режущий край ножа микротома. Можно, однако, распилив кость на мелкие кусочки и обтачивая их каким-либо абразивом, получить шлифы – чрезвычайно тонкие срезы кости, пригодные для изучения под микроскопом.

Микротом состоит из нескольких частей; главные из них – нож и держатель. Парафиновый блок прикрепляют к держателю, который перемещается относительно края ножа в горизонтальной плоскости, а сам нож при этом остается неподвижным. После того как получен один срез, держатель при помощи микрометрических винтов продвигают вперед на определенное расстояние, соответствующее желаемой толщине среза. Толщина срезов может достигать 20 мкм (0,02 мм) или составлять всего 1–2 мкм (0,001–0,002 мм); она зависит от размеров клеток в данной ткани и обычно колеблется от 7 до 10 мкм. Срезы парафиновых блоков с заключенной в них тканью помещают на предметное стекло. Далее удаляют парафин, помещая стекла со срезами в ксилол. Если нужно сохранить в срезах жировые компоненты, то для заливки ткани вместо парафина используют карбовакс – синтетический полимер, растворимый в воде.

После всех этих процедур препарат готов для окрашивания – очень важного этапа изготовления гистологических препаратов. В зависимости от типа ткани и характера исследования применяют разные методы окрашивания. Эти методы, как и методы заливки ткани, вырабатывались в ходе многолетнних экспериментов; однако постоянно создаются и новые методы, что связано как с развитием новых направлений исследований, так и с появлением новых химических веществ и красителей. Красители служат важным инструментом гистологического исследования в силу того, что они по-разному поглощаются разными тканями или их отдельными компонентами (клеточными ядрами, цитоплазмой, мембранными структурами). В основе окрашивания лежит химическое сродство между сложными веществами, входящими в состав красителей, и определенными компонентами клеток и тканей. Красители применяют в виде водных или спиртовых растворов, в зависимости от их растворимости и выбранного метода. После окрашивания препараты промывают в воде или спирте, чтобы удалить избыток красителя; после этого окрашенными остаются только те структуры, которые поглощают данный краситель.

Чтобы препарат сохранялся в течение достаточно долгого времени, окрашенный срез накрывают покровным стеклом, смазанным каким-нибудь клейким веществом, которое постепенно затвердевает. Для этого используют канадский бальзам (природная смола) и различные синтетические среды. Приготовленные таким образом препараты можно хранить годами. Для изучения тканей в электронном микроскопе, позволяющем выявить ультраструктуру клеток и их компонентов, применяют другие методы фиксации (обычно с использованием осмиевой кислоты и глутаральдегида) и другие среды для заливки (обычно эпоксидные смолы). Специальный ультрамикротом со стеклянным или алмазным ножом позволяет получать срезы толщиной менее 1 мкм, а постоянные препараты монтируют не на предметных стеклах, а на медных сеточках. Недавно были созданы методы, позволяющие применять ряд обычных гистологических процедур окрашивания после того, как ткань была подвергнута фиксации и заливке для электронной микроскопии.

Для описанного здесь трудоемкого процесса необходим квалифицированный персонал, однако при массовом производстве микроскопических препаратов используют конвейерную технологию, при которой многие этапы обезвоживания, заливки и даже окрашивания производятся автоматическими приборами для проводки тканей. В тех случаях, когда необходимо срочно поставить диагноз, в частности во время хирургической операции, ткани, полученные при биопсии, быстро фиксируют и замораживают. Срезы таких тканей изготавливают за несколько минут, не заливают и сразу окрашивают. Опытный патоморфолог может по общему характеру распределения клеток сразу поставить диагноз. Однако для детального исследования такие срезы непригодны.

Гистохимия.

Некоторые методы окрашивания позволяют выявлять в клетках те или иные химические вещества. Возможно дифференциальное окрашивание жиров, гликогена, нуклеиновых кислот, нуклеопротеинов, определенных ферментов и других химических компонентов клетки. Известны красители, интенсивно окрашивающие ткани с высокой метаболической активностью. Вклад гистохимии в изучение химического состава тканей постоянно возрастает. Подобраны красители, флуорохромы и ферменты, которые можно присоединить к специфическим иммуноглобулинам (антителам) и, наблюдая связывание этого комплекса в клетке, идентифицировать клеточные структуры. Эта область исследований составляет предмет иммуногистохимии. Использование иммунологических маркеров в световой и электронной микроскопии способствует быстрому расширению наших знаний о биологии клетки, а также повышению точности медицинских диагнозов.

«Оптическое окрашивание».

Традиционные гистологические методы окрашивания сопряжены с фиксацией, которая убивает ткани. Методы оптического окрашивания основаны на том, что клетки и ткани, различающиеся по толщине и химическому составу, обладают и разными оптическими свойствами. В результате, используя поляризованный свет, дисперсию, интерференцию или фазовый контраст, удается получать изображения, на которых отдельные детали строения хорошо видны благодаря различиям в яркости и (или) окраске, тогда как в обычном световом микроскопе такие детали малоразличимы. Эти методы позволяют изучать как живые, так и фиксированные ткани и исключают появление артефактов, возможных при использовании обычных гистологических методов.

Значение нервной ткани в организме определяется основными свойствами нервных клеток (нейронов, нейроцитов) воспринимать раздражение, приходить в состояние возбуждения, вырабатывать импульс и передавать его.

Нервная ткань состоит из нейронов (neuronum ), выполняющих специфическую функцию, и нейроглии (neuroglia ), обеспечивающей существование нервных клеток и осуществляющей опорную, трофическую, разграничительную, секреторную и защитную функции.

Признание нейрона основным элементом нервной ткани – главное достижение нейроанатомов начала XX в. Физиологи определили, какими электрическими и химическими способами нейрон передает свои сигналы. Эти два достижения не раскрывают, каким образом работает мозг, но они служат необходимым фундаментом для этого.

Прогресс в детальном изучении строения мозга связан с успехами ранних исследований по микроструктуре, проводившихся, например, английским анатомом Аугустом фон Валлером. Онразработал химический метод, позволивший выделять пучки отмирающих нервных волокон (так называемая валлеровская дегенерация). Окрашивание по этому методу помогло установить, что длинные волокна, образующие периферические нервы, – это отростки клеток, находящихся внутри головного и спинного мозга. Некоторые крупные из них можно было даже увидеть с помощью примитивных микроскопов. Хотя микроскопы были и раньше, очень сложные и компактные клеточные структуры мозга с трудом поддавались исследованию. Понадобились новые красители, чтобы отдельные клетки стали хорошо видимыми.

Итальянский анатом К. Гольджи примерно в 1875 г. изобрел метод, при котором одновремен-но окрашивается, по-видимому в случайном порядке, лишь очень малая доля всех клеток данного участка, но зато они окрашиваются целиком. При хорошо выполненном окрашивании по Гольджи на препарате видны лишь несколько нейронов, но каждый из них полностью, со всеми своими ветвями. Просмотрев много срезов мозга, окрашенных по Гольджи, анатом может дать перечень разных клеток в этой ткани. До сих пор неизвестно, как и почему срабатывает метод Гольджи, окрашивая полностью одну из 100 клеток и совершенно не затрагивая все остальные.

Современник К. Гольджи – испанец С. Рамон-и-Кахал посвятил всю свою плодотворную жизнь приложению нового метода практически ко всем частям нервной системы. Его гигантская «Histologic du systеme nerveux de l’homme et des vertebres» («Гистология нервной системы человека и позвоночных животных»), впервые опубликованная в 1904 г. на испанском языке, до сих пор остается самой фундаментальной монографией по нейробиологии. Во времена Рамон-и-Кахала шел спор о степени непрерывности между клетками. Отделены ли клетки одна от другой полностью, или же они соединены от аксона к дендриту в непрерывную сеть? Если бы существовала непрерывность протоплазмы, то сигналы, генерируемые одной клеткой, могли бы переходить в соседнюю, не прерываясь; если же непрерывности нет, то тогда должен существовать специальный процесс генерации сигналов заново в каждой клетке.

На препаратах Кахала, окрашенных по Гольджи, выявляется множество обособленных, полностью окрашенных клеток, и никогда не было видно ничего похожего на сеть. Таким образом, его первым большим достижением явилось представление о нервной системе как о совокупности отдельных, обособленных клеток, которые сообщаются друг с другом с помощью синапсов.

Кахал внес второй вклад в науку, пожалуй, еще более значительный: собрал множество данных о том, что сложные связи между нейронами не случайны, а высоко структурированы и специфичны. Он дал исчерпывающее описание архитектоники десятков различных структур мозга и в каждом случае идентифицировал и классифицировал разные клетки, а иногда показывал, насколько позволяли его методы, как эти клетки связаны между собой. Стало ясно, что если нейробиолог хочет понять мозг, он должен не только изучить, как построены разные его части, но и раскрыть их назначение и детально исследовать их работу как отдельных структур и в совокупности. Но сначала нужно узнать, как отдельный нейрон генерирует сигналы и передает их следующей клетке.

Долгое время нейроанатомам приходилось довольствоваться подробными описаниями, основанными на световой микроскопии с окрашиванием по Гольджи и по Нисслю (Nissl) (последнее выделяет тела отдельных клеток без дендритов и аксонов). Первым действенным орудием прослеживания связей между разными мозговыми структурами, например между разными областями коры большого мозга или между корой и стволом мозга и мозжечком, явился метод окрашивания, который предложил в начале 50-х годов XX в. в Голландии У. Наута (W. Nauta). Он основан на том, что при разрушении нейрона (механическим, электрическим или тепловым воздействием) отходящее от него нервное волокно дегенерирует и, пока оно еще не совсем исчезло, окрашивается иначе, чем соседние нормальные волокна. Если разрушить определенную часть мозга и через несколько дней окрасить мозг методом Науты, а затем исследовать под микроскопом, то наличие избирательно окрашенных волокон в какой-либо другой и, возможно, даже отдаленной его части будет означать, что эта часть получает волокна от разрушенного участка. Такой метод привел к необычайному расширению и детализации карты мозга.

За последнее десятилетие благодаря новейшим эффективным методам нейроанатомия продвинулась вперед больше, чем за предыдущие 50 лет. Успехи достигнуты отчасти благодаря усовершенствованным химическим методикам и лучшему пониманию того, как различные вещества воспринимаются нейронами и передаются в обоих направлениях вдоль нервных волокон. Типичным примером может служить радиоавтография. Радиоактивное вещество вводится в ту или иную структуру мозга, тела клеток поглощают его, пересылают по своим аксонам, и оно накапливается в их окончаниях. Если затем приготовить срез ткани мозга, наложить его на фотоэмульсию и исследовать под микроскопом расположение проявленных зерен серебра, удается выявить «места назначения» аксонов. Можно вводить другие вещества, которые, наоборот, воспринимаются нервными окончаниями и передаются по аксонам в обратном направлении – к телу клетки, выявляя место возникновения аксона.

Важным достижением явилась методика, разработанная Л. Соколовым в Национальном институте охраны психического здоровья в США. Глюкоза служит «топливом» для нейронов, и в активном состоянии клетки потребляют больше глюкозы, чем в покое. Меченая дезоксиглюкоза усваивается клетками, как если бы это была глюкоза. Она расщепляется, как глюкоза, но продукт первого этапа ее метаболизма не подвергается дальнейшим превращениям. Не имея возможности выйти из клетки, этот продукт скапливается в ней, и степень радиоактивности в определенных клетках указывает на их функциональную активность. Можно поставить, например, такой опыт: ввести это вещество внутривенно лабораторному животному, а затем предъявить звуковой раздражитель; микроскопическое исследование мозга позволит выявить те его области, которые связаны со слухом. Достаточно недавно разработана новая методика – позитронно-эмиссионная томография, которая позволяет обнаруживать с помощью наружных датчиков присутствие дезоксиглюкозы или других веществ, меченных радиоактивными изотопами, испускающими позитроны. Эта перспективная методика делает возможным картирование активных структур мозга in vivo у лабораторного животного или у человека.

Применение всех существующих методик для выявления в первом приближении, без деталей, связей в одной только структуре (скажем, в части коры больших полушарий или в мозжечке) может занять у одного-двух анатомов пять или десять лет. А поскольку мозг состоит из сотен разных структур, становится ясно, что одного только понимания связей в головном мозгу придется ждать еще много лет.

Гистологический препарат является основным объектом изучения.

Он должен быть тонким (5-10 мкм), прозрачным, легко пропускать пучок света и может представлять собой тонкий срез органа, тотальный препарат (напр., мягкая мозговая оболочка), отпечаток органа (напр., отпечаток печени или селезенки), мазок (напр., мазок крови или костного мозга), пленку из ткани (рыхлая соединительная ткань).

Классическим и основным объектом исследования в гистологии продолжает оставаться фиксированный и окрашенный срез ткани или органа.

Процесс изготовления гистологического препарата включает следующие основные этапы:

1) взятие материала и его фиксация;

2) уплотнение материала;

3) изготовление срезов;

4) окрашивание срезов;

5)заключение срезов в бальзам или другие прозрачные среды (полистирол, целлоидин).

Фиксация микропрепарата

Фиксация заключается в том, что взятый из органа маленький кусочек (3-5 мм) погружают в фиксатор (формалин, 70 0 спирт и др.). Фиксация предотвращает процессы разложения и тем самым способствует сохранению целостности структур, коагуляции белков и прекращению жизнедеятельности, а структуры становятся мертвыми, фиксированными.

Уплотнение микропрепарата

Для уплотнения кусочков применяют различные вещества, чаще всего парафин, целлоидин, органические смолы. Залитые в уплотняющие среды кусочки приобретают пластичность, необходимую для приготовления из них тонких срезов.

Изготовление срезов

Приготовление срезов толщиной от 5 до 50 мкм производят на специальных аппаратах – микротомах.

Окрашивание срезов

Окрашивание срезов применяют для увеличения контрастности отдельных гистологических структур при рассматривании их в микроскопах. Методы окрашивания гистологических срезов очень разнообразны. При обработке срезов красителями происходят сложные химические и физические процессы.

Гистологические красители подразделяют на кислые, основные и нейтральные.

Структуры, хорошо окрашивающиеся кислыми красителями, называются оксифильными , а окрашивающиеся основными красителями – базофильными. Структуры, воспринимающие как кислые, так и основные красители, являются гетерофильными или нейрофильными . Наиболее часто употребляемые красители – гематоксилин и эозин. Гематоксилин окрашивает ядра клеток в фиолетовый цвет, эозин – кислый краситель, окрашивающий цитоплазму в розово-желтый цвет. Окрашенные препараты далее обезвоживают в спиртах возрастающей крепости и просветляют в ксилоле.

Для длительного хранения гистологический срез заключают между предметным и покровным стеклами в бальзам или другие вещества. Готовый гистологический препарат может хранится много лет и быть использован для изучения под микроскопом.

Методы выявления элементов нервной и эластической тканей.

Нервную ткань для гистологического исследования заливают в парафин, целлоидин и желатин. Методика заливки в парафин и целлоидин никаких особенностей обработки нервной ткани на этой стадии нет

Гистохимия.

Гистохимия , раздел гистологии, изучающий химические свойства тканей животных и растений.

Задача Г. - выяснение особенностей обмена веществ в тканевых клетках (см. Клетка) и межуточных средах. Она изучает изменения свойств клеток в процессе развития, связи между работой, метаболизмом и обновлением зрелых клеток и тканей. Основной принцип гистохимических методик - связывание определённого химического компонента клеток с красителем или образование окраски в процессе реакции. Ряд методов (цитофотометрия, люминесцентная и интерференционная микроскопия) исходит из физических свойств веществ. С помощью разных гистохимических методов можно определить локализацию и количество многих веществ в ткани, их метаболизм (тканевая авторадиография), связи с субмикроскопической структурой (электронная Г.), активность ферментов. Перспективным направлением является также иммуногистохимия. Наиболее точные гистохимические методы, позволяющие исследовать структуры клетки, называют цитохимическими (см. Цитохимия).

Первые специальные гистохимические исследования принадлежат французскому учёному Ф. Распайлю (1825-34). Интенсивно Г. стала развиваться с 40-х гг. 20 в., когда появились надёжные методы определения в клетке белков, нуклеиновых кислот, липидов, полисахаридов, некоторых неорганических компонентов. С помощью гистохимических методик удалось, например, впервые показать связь изменений количества РНК с синтезом белка и постоянство содержания ДНК в хромосомном наборе.